31 / 2025-03-10 15:35:43

孕期高温暴露对子代焦虑样行为的影响及机制研究

高温暴露 胎盘 BDNF 焦虑样行为

全球气候变暖加剧孕期高温暴露风险，其子代神经发育毒性机制亟待阐明。尽管研究表明产前不良环境应激可诱发子代焦虑样行为，但子代受孕期高温影响的跨代路径、孕期高温暴露敏感窗口期尚未明确。

目的

本研究旨在阐明孕期高温暴露对子代焦虑行为的影响及其分子机制，聚焦不同妊娠阶段（孕早、中、晚期及全孕期）的差异效应，为环境应激致神经发育障碍的预防与干预提供理论依据。

方法

将SPF级SD雌性大鼠随机分为5组，每组16只，合笼受孕成功后分为正常饲养（control, CON组）和实验组：孕早期高温暴露组（early-stage heat exposure in pregnancy，EHP组）、孕中期高温暴露组（middle-stage heat exposure in pregnancy，MHP组）、孕晚期高温暴露组（late-stage heat exposure in pregnancy，LHP组）和全孕期高温暴露组（whole-stage heat exposure in pregnancy，WHP组）。各实验组分别于孕早、中、晚期和全孕期将母鼠暴露于35℃高温环境8h。每组各取8只于分娩前取胎盘和胚胎，记录每窝胎数和平均重量。苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-Eosin Staining，HE）观察胎盘迷路区形态，采用免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，IHC）对胎盘中的白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）和白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）进行半定量和定位分析。HE染色和Nissl染色用于观察胚胎脑组织前额叶皮质（prefrontal cortex，PFC）的神经细胞形态和发育情况，免疫荧光Iba-1标记胚胎PFC小胶质细胞观察活化状态。另外8只孕鼠用于繁殖子代。子代4周龄时，通过旷场实验、高架十字迷宫和强迫游泳实验评估焦虑样行为。眼球采血取上清，取子代脑组织PFC部位进行病理学检测：HE染色观察神经元形态，Nissl染色评估尼氏体完整性，免疫荧光Iba-1标记小胶质细胞观察活化状态，透射电镜观察神经细胞和突触超微结构。取PFC进行转录组测序，筛选差异表达基因并进行KEGG富集，筛选相关信号通路。采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测血清和PFC中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平。采用Western Blot检测丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase/Extracellular Signal-Regulated Kinase, MAPK/ERK）的磷酸化状态（p-ERK Thr202/Tyr204）、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-Kinase-Protein Kinase B, PI3K-AKT）的磷酸化水平（p-AKT Ser473）、脑源性神经营养因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF）及其受体酪氨酸激酶受体B（Tyrosine Kinase Receptor B, TrkB）的磷酸化状态p-TrkB（Tyr706/707），以及cAMP反应元件结合蛋白（cAMP Response Element-Binding Protein, CREB）的磷酸化状态p-CREB （Ser133）的蛋白表达。

 数据以Mean±SD表示，GraphPad Prism 9.3.0进行单因素方差分析（ANOVA）及统计图绘制，显著性阈值设为P<0.05。Image J 4.0软件对蛋白条带灰度值以及荧光强度进行分析。

结果

1、EHP组和WHP组胎鼠显著减少（P＜0.05），胎盘、胎儿平均重量和子代雌雄比例无显著差异。EHP组胎盘迷路区面积占比显著小于CON组（P＜0.05）。胎盘HE染色显示，高温暴露后迷路区结构紊乱，滋养层细胞核形态不规则，母体血窦狭小，血管间膜增厚。IHC结果显示，与对照组相比，WHP组IL-1β、TNF-α和IL-6表达水平均升高（P＜0.05），MHP组IL-1β和TNF-α表达水平均升高（P＜0.05），LHP组IL-6表达水平升高（P＜0.05）。

胚胎脑组织皮质板神经细胞分布稀疏或堆积，细胞核形态不规则，出现核固缩，细胞质深染，可见空泡化。神经元胞质内可见尼氏体颗粒减少或消失，胞体形态不规则，染色变浅。孕期各阶段高温暴露增加了PFC的小胶质细胞Iba-1的荧光强度（P＜0.05）。

2、子代经孕期高温暴露后显示出不同程度的焦虑样行为，具体表现在：旷场实验中，LHP组和WHP组的大鼠运动总路程显著性减少（P＜0.01）；EHP组、LHP组和WHP组的大鼠的中央区域路程显著性减少（P＜0.01）；LHP组和WHP组的大鼠进入中央区域次数显著少于CON组（P<0.01）。高架十字迷宫实验中，MHP组和WHP组大鼠进入开臂次数显著性减少（P < 0.05）；EHP组、MHP组、LHP组和WHP组的大鼠进入开臂的次数均显著少于对照组（P < 0.05）。强迫游泳实验中，MHP组和WHP组大鼠在水中不动时间明显增多。

WHP组的子代血清和脑组织PFC中的IL-1β、TNF-α和IL-6均显著高于CON组（P < 0.05）。孕早、中、晚期高温暴露不同程度地增加了炎性因子水平，总体来说，MHP组血清中炎性因子水平较EHP组和LHP组增加更显著，而PFC中未见明显此现象。高温暴露后，各实验组均显示出不同程度神经细胞分布稀疏，细胞核形态不规则，边界模糊，出现核固缩，尼氏体颗粒减少或消失，胞体形态不规则，染色变浅，还可见细胞核偏位和核皱缩。 EHP组、MHP组和WHP组的Iba-1标记的小胶质细胞荧光强度显著增强（P＜0.05）。电镜下可见神经细胞核形态不规则，核膜边界模糊不清，线粒体结构异常，突触囊泡数量减少，突触后致密区缩小。

高温暴露后，子代脑组织PFC转录组测序显示，与CON组相比，EHP组、MHP组、LHP组和WHP组均有基因差异表达，差异基因KEGG富集到两条共有通路：MAPK与PI3K-Akt信号通路。子代脑组织PFC中MAPK/ERK（p-ERK）、PI3K和p-AKT蛋白表达水平均显著下降（P均＜0.05），WHP组下降最多，其次为MHP组。上下游调节因子BDNF、p-TrkB、p-CREB蛋白表达水平均显著下降（P均＜0.05），WHP组下降最多，其次为MHP组。这提升提示高温暴露通过抑制BDNF/TrkB轴，阻断了MAPK和PI3K/AKT通路的激活，进而抑制下游转录因子CREB的激活，削弱了突触可塑性，引起子代大鼠表现出焦虑样行为。

结论

孕期高温暴露可通过“胎盘炎症→子代脑小胶质细胞活化→BDNF/TrkB-CREB轴抑制→MAPK/PI3K-AKT通路活性降低→突触损伤”的级联机制，显著增加子代大鼠焦虑样行为风险。