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基于Diels-Alder反应的化学衍生结合LC-MS分析多种生物样本中的7种维生素D

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维生素D（VD）作为一种甾体类激素影响钙稳态的多个方面，研究VD的生理作用可以促进多种相关疾病的机制研究、诊断和治疗[1]。但VD的代谢过程及生理作用涉及多种组织及细胞，且是痕量水平下的高度调控过程，深入理解VD的生理作用需要依赖于能够应用于不同生物样本的高灵敏度分析方法[2]。使用液相色谱质谱联用（LC-MS）方法检测时，由于VD具有特征性的甾体结构，甾体骨架在碰撞诱导裂解（CID）过程中充分碎裂，无法获取合适的特征子离子用于建立多重反应监测（MRM）通道[3]。除此之外，VD的化学结构不具有易电离基团，在电喷雾电离下的离子化效率较低[4]。本工作利用Diels-Alder反应[5]，选取4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione（PTAD）作为衍生化试剂用于标记7种VD。PTAD作为一种亲双烯体，能够特异性的与VD的共轭二烯烃结构发生环加成反应生成六元环。反应得到的VD衍生化产物理化性质稳定且具有刚性平面结构，在CID下产生特征性的碎裂行为，根据其A环结构不同产生298.1 (314.1) m/z及280.1 (296.1) m/z的特征子离子用于建立MRM通道，从而提高VD的检测灵敏度及特异性。基于该原理，我们建立了一种PTAD标记结合LC-MS分析方法，该方法线性范围宽（0.05-200 ng/mL），日内日间精密度良好 (RSD<16.5%)，最终被成功应用于小鼠肝、肺、肾、心四种组织样本及MLF、RAW264.7两种细胞样本中7种VD的定量检测。